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      一種可激活NIR-II納米探針用于創傷性腦損傷的體內早期實時診斷

      時間:2021-06-28 09:44:44       瀏覽:226

       內容提要

      創傷性腦損傷(TBI)是一種發病率高、死亡率高的急性病。目前早期診斷和對病理過程的實時反饋的方法仍然有限。本文提出了一種第二近紅外窗口(NIR-II)的靶向可激活熒光納米探針(v&A@Ag2S)用于TBI的體內光學成像。V&A@Ag2S的熒光由于能量從Ag2S轉移到A1094發色團而被關閉。經靜脈注射后,V&A@Ag2S基于VCAM1介導的吞噬作用在TBI的炎癥血管內皮中迅速積累,由于A1094TBI的前驅生物標志物過氧亞硝酸鹽(ONOO-))漂白,納米探針實現了Ag2S量子點NIR-II熒光的快速恢復。該納米探針對ONOO-具有高特異性、快速響應和高靈敏度,為TBI的體內早期實時評估提供了方便的方法。

        

      前言

      創傷性腦損傷(TBI)是人類死亡和殘疾的一個重要原因。由于創傷性腦損傷的繼發性損傷包括炎癥、血腦屏障(BBB)破壞、氧化應激、缺氧和缺血等往往是隱形的,因此實現早期實時診斷和有效干預的方法是成功的TBI治療的關鍵。計算機斷層掃描(CT)和磁共振成像(MRI)是經常用于TBI診斷的體內成像方式,它們主要檢測器官的解剖和功能變化,而在檢測TBI基礎的早期分子水平變化方面用處不大。因此,迫切需要開發高靈敏度的新方法來實現TBI的原位早期實時診斷和治療評估。熒光成像技術由于其快速反饋、多信號采集、高靈敏度和不存在電離輻射等固有特性,是實時監測生物體疾病發生和發展的特別有利的方法。第二近紅外窗口(NIR-II, 1000-1700 nm)的熒光成像吸引了很多關注,因為它具有無與倫比的組織穿透(幾厘米)和空間分辨率(10毫米),下一代活體成像技術的首選。早期生物標志物的識別和相關分子探針的開發對TBI的早期診斷至關重要。腦血管系統的過氧亞硝酸鹽(ONOO-)有助于顯著的創傷性腦損傷進展,使其成為創傷性腦損傷的前驅生物標志物。作者報道了一種新型靶向可激活NIR-II納米探針(V&A@Ag2S)的設計和合成,用于TBI早期生物標志物的實時體內成像。由于A1094的吸收光譜與Ag2S量子點的發射光譜有很大的重疊,在沒有ONOO-的情況下,有效能量從Ag2S量子點轉移到A1094的情況下,V&A@Ag2S仍然處于狀態;ONOO-存在時,A1094被氧化,1094 nm處的吸收峰消失,因此,Ag2S量子點被打開,并在1050 nm處誘導熒光信號顯著上升。與VCAM1結合的肽結合使納米探針能夠在TBI區域對表達VCAM1的炎癥內皮具有高的靶向能力。這種新型靶向可激活NIR-II納米探針具有未來臨床應用的潛力。


      結果與討論

      V&A@Ag2S透射電子顯微鏡(TEM)顯示所制備的V&A@Ag2S納米探針的高均勻性,平均核心尺寸為Ag2S量子點直徑約3.3 nm。動態光散射(DLS)測量表明,V&A@Ag2S納米探針在水溶液中的水動力直徑(HD)39.4 nm。在VHPK陽離子肽表面附著后,納米探針的zeta電位由@52.5 mV提高到@2.8 mV。Ag2S量子點具有典型的寬帶吸收和尖銳的NIR-II發射光譜。與A1094偶聯后,在1094 nm處出現了一個強烈的吸收峰,與Ag2S量子點的發射有很大的重疊,保證了Ag2S量子點與A1094之間的高效熒光共振能量轉移(FRET)。作者通過記錄其對各種ROS/RNS的反應來檢測探針的特異性。除了ONOO-/ClO-,沒有其他分析物激活V&A@Ag2S的熒光,表明V&A@Ag2SONOO@具有很強的特異性(1a,b)。在V&A@Ag2S溶液(50 mg×mL-1)中加入不同濃度的ONOO-,V&A@Ag2S1050 nm處的熒光強度與ONOO-的濃度呈線性關系,表明V&A@Ag2SONOO-的定量潛力巨大(1c,d)。V&A@Ag2SONOO-的動態響應在1秒內完成,證明了ONOO-檢測這一強大工具對其極短的半衰期的優越性??紤]到Ag2S量子點在化學上是惰性的,作者研究了A1094與各種ROS/RNS/離子之間的相互作用,以確定參與這一過程的主要因素。為了鑒定添加ONOO-后的A1094的氧化產物,采用HPLC-MS對最終產物進行分析。其機理可以歸因于A1094ONOO@的氧化反應,之后共軛結構被破壞,影響了電子轉移過程,導致1094 nm處特征A1094吸收峰消失。

       

      1。a)不同ROS/RNS分析物和離子加入20 mm時,10 mg×mL-1 V&A@Ag2SNIR-II熒光強度變化。b) ONOO-逐漸加入A1094的吸收光譜(021 mM)。插圖:1094 nm處的吸收強度與ONOO-濃度的函數關系圖。c) V&A@Ag2S在水溶液(50mg×mL-1)中的光致發光回收率為ONOO-濃度 (0-21 mm)的函數。d)1050 nm處的熒光強度與ONOO-濃度的關系圖。

       

      由于VCAM1在多種炎癥性血管疾病的內皮細胞中表達上調,并且已知VHPK多肽偶聯納米顆粒通過VCAM1介導的內吞被攝取,作者首先確定了V&A@Ag2S是否能夠有效內化到炎癥性血管細胞中。作者Cy7.5 (λem = 825 nm)標記,并進一步進行細胞成像處理。人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)TNF-a預處理12小時,然后與Cy7.5修飾的V&A@Ag2S孵育1小時,使用熒光顯微鏡成像。如圖2a所示,在TNF-a處理的HUVECs中可以觀察到Cy7.5強烈的熒光信號,而在未處理的HUVECs中熒光非常微弱。流式定量Cy7.5的熒光強度進一步證實了這一結果血細胞計數(2 b)。熒光免疫組化分析顯示TNF-a顯著增加了VCAM1的表達(2c),表明V&A@Ag2S可以通過VCAM1依賴的細胞內運輸在炎癥內皮細胞中實現高效內化。

       

      2。a) 熒光顯微鏡成像TNF-a處理的HUVECs和未處理的HUVECsCy7.5修飾納米探針在37°C孵育1小時。b)流式細胞術分析Cy7.5修飾納米探針預孵育的HUVECs。PBS孵育的細胞作為陰性對照。c) HUVECsTNF-a處理,并進一步用VCAM1抗體染色(紅色)。比例尺= 50 mm。

       

      為了進一步揭示V&A@Ag2S的細胞內分布,采用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)進行熒光共定位成像。TNF-a處理HUVECs10 mg×mL-11V&A@Ag2S 1 h,再用兩種典型細胞器探針LysoTracker (577/590 nm,溶酶體探針)MitoTracker (490/510 nm,線粒體探針),從而達到特定的成像的溶酶體和活細胞的線粒體。借助Cy7.5的熒光信號,V&A@Ag2S的胞內定位可以通過共焦成像很容易探測3a,c。Cy7.5LysoTracker幾乎完全重疊(3b),表明V&A@Ag2S主要位于VCAM1介導的內吞后的溶酶體中。

       

      3。a) 將細胞與Cy7.5修飾的V&A@Ag2S378C孵育1小時,然后進一步與LysoTracker、MitoTrackerHoechst孵育。b) Cy7.5LysoTracker的共定位圖像顯示這兩個通道之間存在大量重疊。c) 炎癥內皮細胞三維熒光圖像。比例尺= 20 mm。

       

      作者進行了研究其用于細胞內監測的可行性ONOO-的產生。為此,我們使用3-morpholinosydnonimine (SIN-1)誘導內皮細胞氧化應激在體內模擬TBI生成ONOO-。HUVECsTNF-a預孵育,然后與V&A@Ag2S再孵育1 h,然后用或不加SIN-1)刺激。如圖4a所示,在沒有ONOO-的前體 SIN-1的情況下,用V&A@Ag2S處理的HUVECs中沒有檢測到NIR-II熒光信號。相反,在SIN-1中,NIR-II熒光在30 min內產生強烈的熒光,表現出與時間相關的NIR-II熒光信號增強(4b),從而表明納米探針的熒光恢復速度快,在ONOO活體中具有優秀的快速實時檢測能力。通過標準的抗Annexin V-FITCPI雙染色以及流式細胞術評估了V&A@Ag2SHUVECs、人骨間充質干細胞(BMSCs)和小鼠成纖維細胞L929細胞的細胞毒性。在V&A@Ag2S濃度為20-100 mg×mL-1的情況下,細胞在孵育24 h后的存活率估計分別大于83%、91%95%,表明V&A@Ag2S的毒性相對較低。V&A@Ag2S的體內毒性也通過靜脈注射V&A@Ag2S24 h7 d采集血樣進行評估,劑量為2mg×kg-1。血液生化和血液學分析顯示,與對照組相比,指標的波動可以忽略不計,表明納米探針具有較高的生物相容性。

       

      4。a) TNF-a處理的HUVECsV&A@Ag2S (10 mgmL@1)預孵卵1 h,然后用或不加SIN-1 (0.5 mm)刺激。b)不同處理HUVECs細胞質內NIR-II熒光強度的時間跨度。比例尺= 10mm

       

      采用了創傷性腦損傷小鼠模型,評估了所制備的納米探針在體內ONOO-檢測的可行性。采用對照顱骨鉆孔穿刺法在胸苷激酶小鼠右側頭部誘導TBI,以V@Ag2S (VCAM1偶聯的Ag2S QDs,始終on”探針)V&A@Ag2S (A1094偶聯的Ag2S QDs,非靶向探針)作為對照。靜脈注射永久開啟的探針V&A@Ag2S,開始時熒光信號在整個腦區廣泛分布(5)。在捕獲NIR-II熒光圖像的時間跨度內,熒光信號逐漸衰減,雖然由于極高的背景噪聲導致低信噪比,很難將TBI區域與正常腦組織區分開來??杉せ畹?/span>NIR-II探針V&A@Ag2S允許TBI快速特異的熒光成像。如圖5所示,在注射納米探針后,TBI小鼠右腦半球立即出現了NIR-II熒光信號,其他區域均未發現熒光。由于缺乏背景噪聲,在注射后10分鐘內,優越的靶組織與正常組織的信號比(SNR >10.2)實現了體內快速診斷。隨后,病變部位熒光信號穩定增強,表明V&A@Ag2S實現了對內源性RNS的高靈敏度、實時原位檢測。相比之下,在非靶向A@Ag2S探針組和動物對照組(健康小鼠)的大腦半球均未觀察到顯著信號。結果表明,基于這種靶向激活的NIR-II成像策略,ONOO-動態過程很容易在活鼠中檢測到。

       

      5。a)注射V@Ag2S、V&A@Ag2S、A@Ag2S后不同時間點NIR-II熒光在腦血管損傷和健康小鼠中的時間跨度。b)不同處理后小鼠NIR-II熒光成像測定的時間依賴性信噪比(SNR)變化。

       

      結論

      作者開發了一種可激活的靶向NIR-II熒光納米探針,用于快速、靈敏地檢測ONOO-。A1094, ONOO響應染料的吸光度NIR-II地區,成功引入NIR-II表面量子點Ag2S,實現較低的檢出限。利用NIR-II Ag2S量子點的獨特光學特性,證明了這種納米探針用于TBI模型體內RNS檢測的可行性。該NIR-II生物傳感系統的成功開發標志著在體內熒光診斷方面邁出了重要的一步。我們設想,在體內轉換傳感和成像策略在第二近紅外窗口將打開巨大的潛力熒光成像的臨床實踐。

       

      參考文獻

      Chunyan Li,* Wanfei Li+, Huanhuan Liu, Yejun Zhang, Guangcun Chen, Zijing Li,* Qiangbin Wang*, An Activatable NIR-II Nanoprobe for In Vivo Early Real-Time Diagnosis of Traumatic Brain Injury, Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 247 –252. DOI10.1002/anie.201911803.

      https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201911803

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      靶向NIR-II熒光納米探針

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