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      抗體生物素標記操作方法(具體操作步驟和方法含數據)

      時間:2020-04-23 17:10:26       瀏覽:2557

      抗體生物素標記操作方法(具體操作步驟和方法含數據)

        一般每個抗體可以標記3-5個生物素,標記時,生物素與抗體的比率受抗體濃度影響,對于10 mg/ml 的抗體溶液來說,生物素應超過蛋白12倍(摩爾數),對于2 mg/ml 的抗體溶液應超過20倍,生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

          蛋白樣品不得含有疊氮鈉、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。

      一、試劑和器材:

      1、標記反應溶液:0.1M  pH 7.2PBS0.15M sodium chloride

      NaCl 8.77 g ;Na2HPO4·12H2O 32.3g ;NaH2PO4·2H2O 4.5g;加雙蒸水 900mL 左右,用HCl/NaOH 調pH至 7.2,最后定容為 1000mL

      2、 10mM NHS-dPEG4-Biotin配方:稱取0.56mg NHS-dPEG4-Biotin(分子量為587,溶解于95 μl 超純水中,臨用前配置,不可儲存,立刻使用。NHS-PEG4-Biotin容易潮解,開瓶前平衡至室溫。也可以配置200 nmol/L 儲備液:20mg NHS-dPEG4-Biotin溶解于170μlDMSO中,-20穩定幾個月。

      由于NHS-PEG4-Biotin昂貴,而且使用量少,不能保存,配制時,直接將NHS-PEG4-Biotin放入1.5ml EP管中,以實際稱量的NHS-PEG4-Biotin按比率加入超純水。

      3、超濾管

      、Millipore超濾管[0.5ml 10KD]:截留分子量10KD,殘留體積200μl,蛋白回收率95%,7500×g(允許的最大離心力14000×g)離心10min。

      、Millipore超濾管[0.5ml 50KD]:截留分子量50KD,殘留體積80μl,蛋白回收率94%,7500×g(允許的最大離心力14000×g)離心5 min。

      、Amicon Ultra -0.5ml離心超濾管(Millipore),效果更好,典型的最終濃縮物體積:5-15ul。

      二、抗體超濾處理

      標記前需要應用截留分子量為50kDa 的超濾柱對抗體進行標記前純化處理(如果不是抗體,一定要按蛋白分子量來確定超濾柱截留分子量),以除去蛋白樣品中可能含有的疊氮鈉、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物,防止干擾標記反應。

      具體操作步驟:

      1、 于超濾柱中加入200μl 標記反應溶液,加入500ug 單克隆抗體,混勻。

      2、 4℃,6000rpm,離心2min。棄濾液。

      3、于超濾柱中加入100μl 標記反應溶液,混勻。4℃,Max 14000×g,2min。

      4、 重復步驟2 6到7次。

      5、 混勻超濾柱中的殘留的液體,室溫靜置1min。

      6、 將超濾柱反轉倒置于一新的超濾管中,4℃,1000×g,2min,收集濾液。

      7、 取50μl PBS于超濾柱中混勻,靜置1min。

      8、 倒置超濾柱,4℃,6000rpm,2min。收集濾液,與步驟6的濾液合并,4℃放置備用。用標記反應溶液調節抗體濃度到2mg/ml 0.25ml)。

      三、生物素標記抗體

      1、 計算抗體標記需要生物素用量。

          抗體濃度 2 mg/ml時的簡要計算:

      1mL of 2mg/mLIgG (150,000 MW)需要26 μL of  10mM  NHS-PEG4-Biotin

      具體計算方式見附錄一(標記生物素計算

      2、 超濾后的濾液加入NHS-PEG4-Biotin溶液,室溫反應1h。

      3、 葡聚糖凝膠分離純化(去除游離生物素):

      四、葡聚糖凝膠分離純化標記抗體操作步驟:

         (一)、試劑:

       1、純化柱處理液 :100 mmol/L Na0H;

       2、純化柱平衡液: 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4),每升含0.5g NaN3 ,8g NaCl;

      3、樣品洗脫液:同純化柱平衡液;

      4、標記抗體保護液(50×: 10ml0.01MpH7.2 PBS 中加入0.5g BSA,0.2g NaN3。

       

      (二)、凝膠過濾:

          方法見“凝膠過濾法純化微量標記蛋白”

      五、標記抗體的長期保存方法

          將“標記抗體保護液(50×”加入到標記抗體溶液中,使BSA終濃度為0.1%,4 ℃或-20 ℃ 保存。

       

      六、數據記錄:

      抗體濃度:    mg/ml        加入抗體體積:    μl

      標記前抗體體積:   μl     加入NHS-PEG4-Biotin體積:    μl

      純化柱規格:  cm ×   cm   凝膠體積:     ml

      加入標記抗體體積:   μl        

      所有洗脫溶液1ml/管收集,到核酸蛋白檢測儀顯示出峰后,改為0.5ml/管收集,并記錄數據:

      管號

      1

      2

      3

      4

      洗脫液體積

       

       

       

       

      A280

       

       

       

       

      管號

      5

      6

      7

      8

      洗脫液體積

       

       

       

       

      A280

       

       

       

       

      管號

      9

      10

      11

      12

      洗脫液體積

       

       

       

       

      A280

       

       

       

       

       

       

      附錄:

      一、標記生物素計算:

         1、不同抗體濃度時,抗體與Sulfo-NHS-Biotin的比率:

           Sulfo-NHS-BiotinMW:589

       

      Sulfo-NHS-Biotin:抗體

      抗體濃度10-12mg/ml時

      12

      抗體濃度4-7mg/ml時

      16

      抗體濃度1-3 mg/ml時

      20

      抗體濃度0.5mg/ml時

      50

       

       

       

       

       

       

       

       

       2、10mmol/L Sulfo-NHS-Biotin 配方:

      Sulfo-NHS-Biotin                 (mg)

      PBSμl)

      Sulfo-NHS-Biotin                 (mg/μl)

      0.56

      95.1

      0.00589

       

       

       

         3、標記生物素計算加入體積計算:

       

      計算公式

      抗體濃度

        2 mg/ml*

      抗體濃度( mg/ml)

       

      4.5

      抗體加入量(ml)

       

      0.11

      抗體加入量(mg)

       抗體濃度×抗體加入量

      0.495

      抗體的毫摩爾數(其他蛋白注意分子量

      抗體加入量/1500000

      0.0000033

      需要的活化Biotin量(mmol)

      抗體的毫摩爾數×20

      0.000066

      活化Biotin量(mg)

      Sulfo-NHS-Biotin

      (毫摩爾)×589

      0.038874

      需要10mmol/L 活化Biotin體積(μl)

      活化Biotin量(mg)

      /活化Biotin濃度(mg/μl)

      6.6

       

       

      西安瑞禧生物可以提供的定制材料包括有:

      dUTP-biotin

      Biotin-Ubiquitin

      生物素修飾的納米銀探針

      生物素化的殼聚糖Bio-CS

      星形七臂官能化聚己內酯(CDSPCABCL)

      生物素修飾的Pluronic普朗尼克

      生物素修飾二茂鐵Biotin-Fc

      生物素AP-tag標簽的FOXM1真核表達載體

      Biotin-PEG-PLLA-PLL

      聚乙二醇-聚乳酸-二丙烯酸酯(PPA)共聚物

      Mpeg-b-PCL-b-PPEEA聚乙二醇-聚已內酯-聚(氨乙基乙撐磷酸酯)

      PLGA-PPEEA 聚(氨乙基乙撐磷酸酯)-聚乳酸-羥基乙酸共聚物

      PTMC-PEG-PTMC

      生物素修飾的冬凌草甲素脂質體

      葉酸/生物素雙配體修飾的殼聚糖材料

      FA-CS-g-PSBMA 葉酸-殼聚糖-磺酸甜菜堿

      乳糖修飾殼聚糖

      乳糖修飾去甲斑蝥素(Lac-NCTD)

      去甲斑蝥素殼聚糖納米粒(NCTD-CS-NPs)

      Biotin生物素偶聯乳糖

      半乳糖化殼聚糖接枝聚乙烯亞胺galactosylatedchitosan-g-PEI

      RGD多肽偶聯殼聚糖chitosan

      半乳糖修飾的巰基化殼聚糖

      甘草酸表面修飾殼聚糖GA-chitosan

      甲氨喋呤-乳糖?;鶜ぞ厶?/span>MTX-殼聚糖

      甲氨蝶呤生物素化殼聚糖納米粒MTX-Biotin-CS

      生物素修飾β2微球蛋白

      生物素修飾稀土摻雜無機熒光納米顆粒

      生物素修飾螢火蟲熒光素酶

      生物素化微細纖維肽修飾IGF-1

      生物素修飾水溶性共軛聚合物(PFPNBr-biotin)

      BDNF-PEG-biotin

      生物素化乙酰普魯蘭多糖

      FAM-Biotin,FITC-Biotin綠色熒光標記生物素

      Biotin-NHS活化脂修飾生物素

      PHEMA-biotin 生物素修飾聚(甲基丙烯酸-2-羥乙酯)

      PLGA-Biotin 生物素修飾PLGA

      Biotin修飾紅細胞膜

      poly(NIPAAm-co-Ada)

      生物素修飾地高辛藥物

      生物素修飾的多肽RGD

      Biotin生物素修飾CdTe量子點

      生物素化修飾的聚己內酯(PCL/Biotin)

      Biotin-PEG-b-Leu

      鏈霉親和素化的量子點(streptavidin-QDs)

      Prazosin-PEG2000-biotin

      生物素(Biotin)表面功能化修飾多壁碳納米管

      Biotin-PEG-PLL-peptide-DOX

      PLL-PEG-Biotin

      Biotin-PEG-c(RGDyK)

      biotin-HWTX-Ⅰ生物素標記蛛神經毒素虎紋捕鳥蛛毒素-

      ssDNA-Biotin-SA-AuNPs復合物

      生物素標記的透明質酸(HA-biotin

      PAH-Biotin生物素修飾半胱氨酸

      Biotin-Ebselen生物素小分子探針

      生物素偶聯四氨基卟啉

      膽堿磷?;悸摎ぞ厶?/span>

      Chol-Dex-Biotin 膽固醇偶聯葡聚糖修飾生物素

      DOTA-Biotin生物素偶聯大環配體造影

      藻膽蛋白標記生物素Phycobiliprotein-Biotin

      藻膽蛋白-鏈霉親和素(Streptavidin-phycobiliprotein)

      生物素偶聯物OVA-ZEN-biotin

      生物素(Biotin)偶聯的多肽zs6

      Biotin-DNA偶聯物

      雞卵清白蛋白偶聯生物素(Biotin-OVA)

      輔酶A-生物素(Coenzyme A-biotin)

      FITC標記的轉鐵蛋白(Tf-FITC)

      生物素(biotin)修飾的ddNTP核苷酸

      生物素活化的轉鐵蛋白(Biotin-Tf)

      HEMA-biotin-Lys-CD

      蛤蚌毒素-生物素偶聯物

      姜黃素-生物素偶聯物

      多肽CRGD修飾紅細胞膜

      生物素偶聯膽甾醇化乙二醇殼聚糖

      膽固醇-葡聚糖聚醛偶聯物(Chol-Dex-CHO)

       

      生物素BIO修飾阿霉素DOX-biotin

      生物素修飾藥物BIOTIN-Drud

      CY3/CY5/CY5.5-Biotin生物素修飾熒光染料

       

       


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